Critical Care┃寻根溯源，探究脓毒症患者血液中的线粒体能量变化全过程

        脓毒症是进入重症监护病房(ICU)的主要原因之一。目前还没有明确的治疗方法，尽管营养支持性疗法取得了一定进展，但死亡率仍然很高。今天，少数患者在急性休克的初始阶段死亡，而更多的患者则是进入随后更长期的重症监护阶段，其特点是多器官衰竭(MOF)和需要器官支持治疗。脓毒症的初始阶段以全身炎症反应综合征(SIRS)为主。这种促炎反应将逐渐转化为抗炎反应，即代偿性抗炎反应综合征(CARS)。在这一后期，所有主要细胞系，如树突状细胞、淋巴细胞和中性粒细胞的免疫细胞功能均被下调，导致免疫麻痹或无力，这可能促使患者更容易遭受有害的继发性感染。

       瑞典隆德大学临床科学系联合哥本哈根大学医院重症监护室共同针对人体血液中的脓毒症初期和后期的线粒体活性进行了高精度检测，发表题为“Patients with sepsis exhibit increased mitochondrial respiratory capacity in peripheral blood immune cells”一文，文中指出与对照组相比，脓毒症患者的外周血免疫细胞（PICS）线粒体呼吸能力更强，这是由于线粒体含量增加引起的。结果表明，在脓毒症中外周血免疫细胞（PICS）线粒体呼吸功能障碍是不成立的。

       1、样本来源

       实验脓毒症患者从隆德大学医院和哥本哈根大学医院的重症监护室(ICUs)招募，在患者中，使用 K 2 EDTA管从患者的动脉中抽取40ml的血液。对照组采用 K 2 EDTA静脉穿刺采血。采用Ficoll梯度离心法从全血中分离PICS。用生理盐水洗涤后，根据PICS的含量不同，用200 ~ 400 μl的生理盐水重悬细胞，同时用样本本身血浆重悬50 ~ 100 μl。z终浓度在Swelab Alfa血液分析仪中测定。制备后细胞数中位数为100 × 10 6 个/ml。采样后5小时内用Oroboros O2k能量代谢分析仪进行呼吸测量。

       2、实验方法

       使用了两种不同的方法，一种在完整细胞中，另一种在通透性细胞中。在完整的细胞中，测量过程中使用内源血浆作为呼吸介质。

       第一种：

       在完整的活细胞中检测，PICS活细胞悬浮在受试者自己的血浆中，并在所谓的常规呼吸下稳定下来。然后加入寡霉素(1 μg/ml)诱导4态呼吸(LEAK)，其中呼吸主要与线粒体内膜上的质子泄漏有关。通过对解偶联剂FCCP逐步(20 ~ 40 μM)滴定，获得z大氧通量(由等离子体衍生底物支撑)。z后，加入鱼藤酮(2 μM)和抗霉素a (1 μg/ml)对复合物I和复合物III均有抑制作用。添加抗霉素后的剩余氧通量从稳态呼吸值中减去。

      第二种：

      在通透性细胞中进行。待细胞稳定于常规呼吸作用后，加入洋地黄皂苷(6 μg/1 × 106细胞)。同时，添加复合物I底物苹果酸盐和丙酮酸盐，随后添加的过量ADP刺激了呼吸，并代表了复合体I的氧化磷酸化能力（OXPHOS CI）。随后加入谷氨酸、琥珀酸盐进一步刺激了呼吸，评估复合体I+复合体II的氧化磷酸化能力（OXPHOS CI+II），在达到OXPHOS CI+II能力后，用寡霉素抑制ATP合酶，以评价质子漏阶段（LEAK CI+II)。用FCCP逐步滴定法测定z大电子传递量（ETS CI+II）。通过添加鱼藤酮来评估复合体II的电子传递作用（ETS CII），随后，抗霉素A抑制了ETS。此时，通过加入复合物IV的电子供体 TMPD-As来评价复合物IV的活性。由于TMPD具有较高的自氧化水平，叠氮化钠是复合物IV的抑制剂，计算得到的两个水平的差值作为复合物IV的特异性活性。控制率来源于z大fccp刺激呼吸或z大氧化呼吸除以LEAK呼吸。

       3、实验结果：

       结果一：

       在活细胞检测结果中，脓毒症患者48小时的基础呼吸水平（routine）已经出现了明显的增高，而z大呼吸（ETS）在6-7天出现了明显的升高。从整体细胞水平来看，脓毒症患者血液中的外周免疫细胞能量代谢活性高于正常组。

       结果二：

       从透膜细胞水平来看，透膜细胞表达了线粒体复合体的氧化磷酸化情况，即复合体I、复合体II、电子传递水平（ETS）、氧化磷酸化（OXPHOS）、复合体IV等，均从患者48小时起，出现了明显的线粒体能量代谢活性升高。

       结果三：

       实验人员将线粒体氧化磷酸化能力（OXPHOS CI+CII）与柠檬酸合成酶（CS）、线粒体DNA（mtDNA）、细胞色素c（Cyt c）等进行了线性关联，用来评估线粒体能量代谢升高与线粒体数量之间的关系，结果显示，线粒体氧化磷酸化能力与线粒体数量成正比，可见，线粒体能量代谢升高是由于线粒体数量增加导致的。

       结果四：

       实验者将线粒体氧化磷酸化数据进行以CS、mtDNA为基准的归一化处理，发现归一化之后的能量代谢数据差异消失，且原本归一化前无差异的Leak阶段，归一化后出现了差异，因此，可以确定脓毒症患者的PSCI细胞内产生的线粒体能量代谢升高与线粒体数量增多有直接关系，与线粒体本身的功能情况无关。

       结果五：

       最后，实验对比了幸存者和非幸存者之间的线粒体能量代谢（OXPHOS CI+CII）情况，经CS、mtDNA以及Cyt c的归一化后，二者线粒体能量代谢活性无差别。

       实验结论：

       实验研究发现，在脓毒症的d一周，由于线粒体含量的增加，PICS的细胞呼吸能力增加，同时OXPHOS系统的效率也提高了。非幸存者的线粒体能量代谢能力与幸存者相同。目前的研究结果反对PICS细胞在脓毒症中出现线粒体呼吸功能障碍这一说法；而且结果很明显，线粒体功能bixu与各种特异性标记物相关，进行线粒体数量的归一化处理，才能够将细胞能量代谢异常的来源进行解释。